基因治疗关键质量属性分析技术进展

基因治疗通过病毒载体或非病毒载体将外源DNA或RNA导入到靶细胞内，覆盖或编辑有缺陷基因，恢复其正常功能。目前临床实验中有数百种基因治疗候选药物正在进行严格评估，其中以基于AAV为载体治疗方法为主，涵盖了先天代谢障碍、眼科、肌肉骨骼、神经等多个领域的罕见病、遗传性疾病和后天获得性疾病，随着更加优化的基因载体、递送系统和技术进步，基因治疗展现了巨大的临床应用潜力。基因治疗产品采用独特的递送和治疗方式，与传统小分子和大分子药物相比，现有的分析技术不能满足这些复杂疗法的定量分析需求，需要开发全面的新型分析测试方法来证明此疗法的安全性和有效性。

基因治疗领域目前最常用病毒载体之一是腺相关病毒（AAV），以AAV作为载体开发基因治疗药物时，必须对多种关键质量属性进行检测，包括但不限于衣壳蛋白比例和纯度、衣壳蛋白等电点、病毒滴度、不溶性微粒等，以确保最终产品安全有效。同时转基因蛋白表达的功能性蛋白质，特别是当功能性蛋白质与临床治疗效果相关联，可作为疗效评估和监测的生物标志物时，蛋白质准确定量非常关键。针对以上关键性技术指标，ProteinSimple内部科学团队和合作伙伴开发了多种创新性分析工具，用于细胞与基因治疗关键质量参数分析，加速相关疗法的开发的质量和速度。

ProteinSimple是美国纳斯达克上市公司Bio-techne集团（NASDAQ:TECH）旗下行业领先的蛋白质分析品牌。ProteinSimple长期致力于研发和生产更精准、更快速、更灵敏的创新性蛋白质分析工具，包括蛋白质电荷表征、蛋白质纯度分析、蛋白质翻译后修饰定量检测、蛋白质免疫实验如数字Western和ELISA定量检测蛋白质表达等技术，帮助生物制药、细胞治疗、生物医学和生命科学等领域科学家解决蛋白质分析问题。在基因治疗领域，ProteinSimple创新性分析工具能支持基因治疗从早期发现到质量控制的工艺流程，解决产品关键质量属性。

ProteinSimple技术解决方案路线图

毛细管电泳用于AAV分析创新性方案

ProteinSimple主要具有毛细管电泳技术为基础多种平台，Maurice系统是全柱成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF）和CE-SDS双功能毛细胞电泳品牌，两种技术都已经被纳入2020版《中国药典》，用于抗体药物电荷异构体和纯度表征。iCIEF已经基本取代了传统等电聚焦电泳（IEF）技术，CE-SDS在工业界中大分子抗体分析方面逐渐替代SDS-PAGE，从抗体大分子药物表征发展历史来看，自动化创新性毛细管电泳技术是趋势和必然。目前，Maurice毛细管电泳技术已经被用于AAV载体的表征。同样基于毛细管电泳技术Digital Western blot（也称为Simple Western）结合了免疫学和CE-SDS技术，可通过蛋白质大小或等电点（电荷）来表征AAV工艺开发工程中复杂样本，使用特异性抗体以高灵敏度技术鉴别污染物种类，对AAV生产工艺进行更深入分析。将Maurice毛细管电泳和CE-SDS免疫学检测联合使用，可分析表征AAV从早期发现到纯品质量控制多个不同阶段特征。

一、AAV衣壳蛋白比例和纯度

传统的SDS-PAGE方法耗费人力、重复性差、且只能达到半定量。与之相比，ProteinSimple开发的CE-SDS和Simple Western Size方法无论从灵敏度、定量性还是重现性来说，都远远优于传统SDS-PAGE。

图1展示了Maurice CE-SDS检测供应商提供的原始配方中AAV2的代表性电泳图，AAV2的三个衣壳蛋白达到基线分离，且VP3可分离出2个尖峰。

图1. AAV2 样本的 CE-SDS 分析。

黑色为 AAV2 样本，蓝色为空白对照。三种衣壳蛋白都被检测到。

通过记录每次进样 VP3、VP2 和 VP1 的峰面积，可计算平均 RSD 和 %RSD（表1）。结果表明，VP3、VP2 和 VP1的 RSD 分别为 0.76、4.03 和 4.86%，衣壳比为 7.9 : 1.3 : 1。这些数据表明，CE-SDS 可以快速、简便地表征 AAV2，并且不需要进行复杂的前处理。

表1. AAV2样本CE-SDS重复进样定量结果，两种样本各进样三次。

图2展示了Simple Western Size的总蛋白染色和常用的SYPRO RUBY的灵敏度对比。同样的AAV2 样本从1:5开始2倍稀释到1:160，同时进行SYPRO RUBY和Simple Western 总蛋白染色检测。结果发现Simple Western可以检测低至150pg的蛋白，而SYPRO RUBY只能检测到1ng的蛋白。AAV2梯度稀释后，同时在SDS-PAGE（后续SYPRO RUBY染色）和Jess 5XTP上对比检测（左），Jess 5XTP所有稀释度呈强线性相关，可以检测低至1:160稀释的蛋白（右）。

 图2. SUPRO RUBY和Simple Western Size总蛋白染色的对比。

二、AAV衣壳蛋白等电点分析

除了衣壳蛋白的分子量比例以外，衣壳蛋白的等电点也是不同型别AAV的特性之一。而且根据文献报道，衣壳蛋白的翻译后修饰，例如脱酰胺化，与载体活性丢失相关，并会影响衣壳组装和转导效率。而泛素化和磷酸化修饰会影响病毒进入细胞。糖基化则会影响衣壳加工和成熟，因此衣壳蛋白的电荷变异体图谱也可作为病毒载体稳定性研究的工具。通过iCIEF分析，可稳定和高分辨率区别不同AAV血清型，有望作为AAV载体稳定性研究的重要工具。

图3. Maurice 变性icIEF检测9种商品化的AAV，采用蛋白天然荧光检测（不添加染料）。

图4. Maurice变性icIEF检测后用天然荧光模式检测，加热的AAV2（橙线）和对照样本（蓝线）相比，谱图明显不同。这表明95℃加热5min的处理已经改变了样本。

三、AAV病毒物理滴度自动化快速检测

国内外AAV载体研发和生产公司需要检测病毒滴度，常规利用PCR技术检测病毒基因组滴度、TCID50检测病毒感染滴度、ELISA技术检测病毒物理滴度或利用光散射技术检测病毒颗粒数。ELISA作为病毒物理滴度检测技术被广泛采用，但是传统ELISA方法操作步骤多、时间长、重复性差和自动化程度低。鉴于此，ProteinSimple基于Ella全自动微流控ELISA技术平台，开发了AAV病毒滴度自动化检测方案。Ella AAV2试剂盒可检测病毒生产工艺过程中衣壳完整的AAV2滴度，将双抗体夹心法和Ella微流控技术结合，抗体来自于PROGEN公司AAV2(A20R)抗体。与传统ELISA技术相比，Ella解决方案具有更宽动态范围，实现了自动化、微量样本、快速可重复性病毒滴度检测。

图5. Ella AAV2滴度检测动态范围。

为了更好符合病毒载体生产和纯化工艺流程，Ella软件符合21 CFR Part 11要求，使Ella能同时满足早期工艺开发和GMP环境下质控要求。

四、AAV制剂和工艺过程中不溶性微粒分析

对于注射剂来说，药典要求对微米尺度的不溶性微粒进行限度控制。ProteinSimple的MFI微流成像颗粒计数分类系统不仅能满足现有药典的要求，更可覆盖 <USP1787>推荐的粒径尺度（2-5μm，5-10μm）。MFI除了提供微粒粒径、数量信息以外，还能提供微粒图片，以辅助微粒分离，帮助判断微粒来源。配合自动进样系统，可以一次自动检测多达90个样本，非常适合AAV制剂评价和工艺优化。

美国Voyager Therapeutics公司正在开发新型AAV基因疗法，其科学家利用MFI研究病毒浓缩超滤工艺开发过程中产生的颗粒。当AAV2和AAV9两个血清型通过复合再生纤维素（CRC）超滤膜时，膜截留分子量和操作条件对通量影响。下图结果展示1到10μm之间颗粒采用MFI检测时存在明显差异。两个批次A和B实验，对于给定的膜批次，当处理时间较长时，亚可见微粒浓度较高。与较低TMP 6.5 psig相比，当采用更高TMP（20 psig）进行超滤时，亚可见微粒浓度降低。这归因于较低TMP下超滤时，泵通过管道和通道次数增加导致。

图6. MFI用于不同渗透率RC2A膜超滤的AAV2样本的颗粒评价。

上图为批号为Lot A样本，下图为Lot B样本。

五、基因治疗中功能性蛋白质及相关蛋白质精准定量

基因疗法作为一种新型治疗手段，其PK/PD分析技术需要与时俱进，不断吸收新的技术来评估治疗产品的生物分布、持久性、疗效和免疫原性。目前慢病毒或腺相关病毒是常见的载体，评估病毒的生物分布和转导效率，通常采用PCR或dPCR方法在DNA和mRNA水平测量靶基质中病毒载体。通过测量疾病生物标志物、转基因表达的功能性蛋白质水平和相应酶的活性来决定疗效。在临床前和临床研究中，直接测量转基因表达的功能蛋白质对于表征药物代谢动力学和药物效应动力学（PK/PD）特性至关重要。但基因治疗中转基因表达的功能性蛋白质及相关通路蛋白质的量化分析面临许多挑战，特别是当功能性蛋白质与临床治疗效果相关联，可作为疗效评估和监测的生物标志物时，蛋白质准确定量非常关键。全自动Digital Western blot系统可用于AAV、RNA药物和基因编辑等多种技术路径的项目，对先天代谢障碍、眼科、肌肉骨骼、神经等领域功能性蛋白质进行快速高精准高重复定量检测，用于临床前和临床开发。适用于细胞水平、组织水平、类器官和人体组织活检样本等来源的蛋白质分析。

案例分享：抗肌萎缩蛋白（Dystrophin）是杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）临床治疗效果评估的重要指标。目前临床获批产品主要是恢复抗肌萎缩蛋白表达，采用Western blot或质谱来定量检测蛋白表达水平的变化。传统Western blot重复性和灵敏度都有问题，基于毛细管技术为基础的免疫学检测，即全自动Digital Western blot技术，以其优异技术性能和先进性，将成为临床前和临床上Dystrophin精准定量的解决方案。

荷兰BioMarin公司科学家Beekman等发表文章（Beekman, Plos One, 2018），结论证明了毛细管免疫印迹实验（Capillary Western Immunoassay）是一个合适、高效和可靠的方法，可用于定量DMD临床药物开发种生物标志物抗肌萎缩蛋白。

Digital Western blot系统优势是自动化，3小时快速分析，不需要跑胶和转膜，需求更少量样本和抗体。测试了四个不同抗体可识别不同抗肌萎缩蛋白表位（NCL-dys1，Manx59b，Ab154168和Mandys106），采用Digital Western blot定量抗肌萎缩蛋白具有高灵敏度和宽动态范围。采用0.125 ug总蛋白，定量范围从0.5%到100%，可检测到0.125%轻微水平增加。系统对抗肌萎缩蛋白定量的重现性符合FDA/EMA定量生物化学分析方法规定，即使抗肌萎缩蛋白在较低浓度范围和不同操作者之间，重复测量之间的CV值小于20%。

除了抗肌萎缩蛋白应用案例外，基于毛细管技术的Digital Western blot以其优异的技术先进性和性能，已经被国内外领先的基因治疗公司采用，如MeiraGTx、Sarepta therapeutics、Biogen、Pfizer、Arcturus therapeutics、CRISPR therapeutics和Bluebird bio等，成为基因治疗临床前和临床研究治疗性蛋白质定量检测重要工具，特别是用于各种罕见病基因治疗项目。

过去几年，全球科研人员一直努力改变和提升细胞与基因治疗药物治疗效果，同时也在研发和改进相关的研究方法和技术平台。为了确保获得一致性结果，从早期发现阶段到制造阶段，高效的分析方法和平台至关重要。例如病毒载体生产过程中，需要依赖多种不同分析技术来评估病毒载体工艺的关键质量属性。为了满足工业界对快速、重复性和自动化平台的快速需求，ProteinSimple开发了一系列病毒载体和蛋白质分析方案，来驱动细胞与基因治疗行业发展。

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参考文献：

1. ProteinSimple. eBook: next-generation analytical solutions for cell & gene therapy (2020).

https://info.proteinsimple.com/next-generation-analytical-solutions-cell-and-gene-therapy.html

2. ProteinSimple. Fast and reproducible adeno-associated virus 2 vector quantification with simple plex assays on Ella™ (2021). https://www.proteinsimple.com/documents/AN Fast-and-Reproducible-AAV2 STRY0156312.pdf

3. Abhiram Arunkumar, Nripen Singh. Ultrafiltration behavior of recombinant adeno associated viral vectors used in gene therapy. Journal of Membrane Science, volume 620,2021

4. Chantel Beekman, Anneke A Janson, et al. User of capillary Western immunoassay (Wes) for quantification of dystrophin levels in skeletal muscle of healthy controls and individuals with Becker and Duchenne muscular dystrophy. Plos one, 2018.

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